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腺伴随病毒PCR试剂盒的PCR反应条件设置

的PCR反应条件设置:

a)预变性:95℃,5 min可以让白细胞裂解,释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度。

b)退火温度:退火温度设置为引物Tm值即可。然而,使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增,并提高全血模板的扩增效率。因此,如扩增产物特异性较差,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板zui适退火温度。

c)延伸时间:按30 sec/kb设定,如不足30 sec,设置30 sec即可。

d)扩增循环数:35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。

PCR完成后,建议将反应液于1000× g (大约4000 rpm) 离心1~3 min以沉淀血细胞碎片,之后取上清进行下游分析。该步骤可有效去除多种血液组分。当使用高浓度血液模板时此步尤为重要,因为经过PCR循环,反应管中会存在大量的血细胞碎片。这些碎片会干扰下游的检测,如琼脂糖电泳检测。注意:由于血液本身的原因,PCR 结束后在 PCR 管的底部会出现透明凝胶状物质,此为正常现象。

 

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